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温度作为一种基本物理量，在细胞代谢、基因表达、信号转导和免疫反应调节等细胞过程中起着重要作用。因此，细胞温度的精准分析为理解细胞中温度相关的生命过程提供了有效手段，并有望辅助开发光热治疗和免疫治疗等疾病治疗新策略。然而，细胞特定局域位置的精准温度探测仍然面临诸多挑战，如细胞内外复杂微环境对测温准确性的干扰严重和细胞局域位置的靶向标记困难等。
鉴于此，福州大学杨黄浩教授和宋晓荣副研究员等人开发了一种基于生物正交修饰稀土上转换发光纳米温度计的细胞膜高光谱温度成像新策略。研究人员制备了铒离子掺杂的核壳结构稀土上转换发光纳米晶（UCNPs），利用铒离子的热耦合能级用于高灵敏比率型上转换发光测温。为了实现细胞膜的特异性标记，作者制备了二苯并环辛炔（DBCO）功能化的UCNPs，并利用糖代谢工程对细胞膜标记叠氮基团，通过点击化学反应有效地将UCNPs标记到细胞膜上。同时，作者搭建了上转换发光高光谱成像平台用于细胞膜原位实时高光谱成像和细胞内钙内流成像分析。该方法不仅克服了细胞内自荧光背景干扰，实时获取细胞膜上各像素点的上转换发光光谱与成像信息，也可以利用比率型发光信号提高温度探测的准确度，从而实现免疫细胞膜温度的实时监测。基于此，作者揭示了细胞膜温度状态与细胞钙内流之间的关系，从而指导了T细胞的有效免疫调节。相关工作以“A Lanthanide Upconversion Nanothermometer for Precise Temperature Mapping on Immune Cell Membrane”为题发表在《Nano Letters》上。
图1. 生物正交稀土上转换发光纳米温度计用于免疫细胞膜温度成像示意图。
细胞膜靶向的稀土纳米温度计的设计合成
作者利用共沉淀法合成了高质量核壳结构NaGdF 4: Yb/Er@NaGdF 4上转换发光纳米粒子，通过酸洗法除去表面疏水性配体后，用聚乙烯亚胺（PEI）将纳米粒子表面氨基化，随后利用NHS与NH 2之间的酯化反应得到NPs-DBCO。基于铒离子的热耦合能级，该纳米温度计在525 nm和545 nm处的上转换发光强度比ln（L 525/L 545）与温度的倒数（1/T）呈线性相关，37 ℃下的温度响应相对灵敏度达到1.4% K -1。
作者通过糖代谢工程对细胞膜标记叠氮基团，从而凭借生物正交点击化学反应高效快速地将NPs-DBCO标记到免疫细胞膜表面。共聚焦成像结果表明NPs-DBCO可以快速（~30 min）标记糖代谢工程化后的免疫细胞膜，细胞共定位分析结果显示NPs-DBCO与细胞膜标记染料Cell Mask TM Green的共定位系数超过80%。
图2. UCNPs的发光能级跃迁、电镜表征、光谱表征和温度响应曲线图。
图3. 免疫细胞糖代谢工程化与NPs-DBCO的细胞膜标记分析。
上转换发光高光谱细胞膜测温成像
作者利用活细胞工作站控制细胞温度，通过高光谱显微成像平台首先建立了上转换发光信号与细胞膜温度的标准工作曲线。随后将NPs-DBCO标记的免疫细胞与细胞钙离子响应染料Fluo-4共孵育标记，通过高光谱温度成像技术揭示了细胞膜瞬时温度与细胞内Ca 2+信号之间的相关性。从数据中可以发现最高的钙流入率出现在38.2±0.5℃。特别地，上转换发光高光谱成像可以同时获取细胞膜成像与光谱信息，有力克服了纳米温度计标记不均、悬浮细胞移动等干扰，实现了细胞膜温度的准确监测。
图4. 基于NPs-DBCO的细胞膜高光谱温度成像。
温度调控的免疫细胞活化
基于免疫细胞膜温度与钙内流之间的关系，作者进一步评估了不同温度下T细胞的活化水平（CD69分子表达）。流式细胞分析显示，当细胞温度从37 ℃升高到38.2 ℃时，CD69的表达显著增加，而进一步升温到40 ℃时，CD69表达仅略微增加。这可能是由于测得的38.2 ℃时Ca 2+流入率最高，而在过高的温度下，内质网-细胞膜之间的连接受到破坏导致免疫激活受阻。因此，细胞精准测温对T细胞的免疫激活调节具有重要意义。
图5. 温度敏感的免疫细胞钙内流与免疫激活原理及流式细胞分析结果。
小结：本文展示了基于生物正交修饰稀土上转换发光纳米温度计的免疫T细胞膜温度测量分析新策略。该工作通过糖代谢工程和点击化学反应对细胞膜高效标记上纳米温度计，并结合上转换发光高光谱成像技术与比率型温度传感，实现了免疫T细胞膜温度的精准监测成像，这是传统温度传感染料和纳米探针所没有实现的。该工作也揭示了免疫T细胞的细胞膜温度依赖性Ca 2+内流，并指导了T细胞的有效免疫激活。得益于稀土纳米晶的多功能表面修饰与优异发光等特性，不同细胞局域位置的精准温度测量将有望实现，并加深我们对细胞内热相关过程的理解，进而推动疾病治疗策略的发展与应用。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.2c03392
来源：BioMed科技
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