南京医科大学研究生(南京医科大学研究生院官网)




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雄性生育能力的关键!

核糖体是高度复杂的转译机器,已被证明在调节蛋白质合成方面具有异质性。男性生殖细胞的发育涉及精子形成过程中复杂的翻译调节。然而,目前仍不清楚精子形成过程中的翻译是否由一个特定的核糖体完成。近日,南京医科大学沙家豪教授郭雪江教授联合中科院生物物理研究所秦燕教授报告了一个具有专门的新生多肽出口通道的核糖体–核糖体ST,它与雄性生殖细胞特异性蛋白RPL39L–核心核糖体蛋白RPL39的类似物组装在一起小鼠体内核糖体ST的缺失会导致精子形成缺陷,从而导致生育能力大幅下降。作者对来自小鼠肾脏和睾丸的核糖体的单颗粒低温电子显微镜结构的比较表明,与核心核糖体蛋白相比,核糖体ST具有一个具有不同大小和电荷状态的核糖体多肽出口通道。核糖体ST主要通过共翻译方式调控男性生殖细胞特异性蛋白子集的折叠,这些蛋白对精子的形成至关重要。总之,这种精子特异性核糖体的鉴定应极大地扩展作者对核糖体功能和哺乳动物蛋白质表达模式的组织特异性调节的理解。相关成果以“A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility”为题发表在最新一期《Nature》上。

RP蛋白质组学确定了核糖体ST

为了评估不同组织中核糖体的异质性,作者对9个小鼠组织的80S单体进行了蛋白质组学分析。作者确定了84个核糖体蛋白(RPs),包括50个大亚基RPs和34个小亚基RPs(图1a),代表了迄今为止在蛋白质组学分析中进行的最全面的RP分析之一。当对不同组织间异质性的RPs进行统计分析时,作者发现有62个RPs显示出明显的丰度差异(图1b)。RPs在集群1和2的睾丸和脂肪中显示出较高的水平,而在集群3和4的脾脏中显示出较高的水平(图1b)。RPL3L在心脏和骨骼肌中特异性表达(图1b)。通过平行反应监测(PRM)对80S单体进行相对定向定量,证实RPL39L和RPL10L蛋白以睾丸特异性方式表达(图1c)。在出生后小鼠的睾丸中,可以在1-4周的时间范围内连续观察到精原细胞、精母细胞、圆形精子和拉长精子(ES)的发育。作者选择了出生后第1周、第2周、第3周和第4周的小鼠睾丸来构建80S单体蛋白质组图谱(图1a)。统计分析证实,来自60S亚单位的5个RPs差异很大(图1d),表明RPL39L完全纳入核糖体ST中。

为了评估核糖体ST是否只在生殖细胞中表达,作者从小鼠睾丸中纯化了精原细胞、精母细胞、圆精母细胞、胚胎干细胞、间质细胞和Sertoli细胞。Rpl39l的mRNA和蛋白水平从精原细胞到精母细胞逐渐增加,而Rpl39的水平则逐渐下降(图1e)。结果表明,在精子发生过程中,RP同族体的不同表达对核糖体的异质性具有关键作用

图 1:9 个小鼠组织和睾丸在精子发生不同阶段的核糖体蛋白质组学分析

移除核糖体ST导致男性不育症

为了评估核糖体ST的功能重要性,作者制作了三个Rpl39l-/-小鼠品系(核糖体ST-/-)。核糖体峰的分析发现80S单糖体峰有明显下降(图2a)。雄性核糖体ST-/-小鼠的表型分析显示,与野生型小鼠相比,其睾丸尺寸较小,睾丸/体重比例较低,精子头部和尾部异常的比例增加,严重的不孕不育,累计出生的活仔数明显减少(图2b,c)。当作者分析尾部附睾的精子时,作者发现核糖体ST-/-小鼠的精子数量、活力和渐进运动能力都有所下降(图2d)。

图2:核糖体ST导致男性生育力低下和ES蛋白减少

核糖体ST-/-ES中的蛋白质减少

作者接下来分析了核糖体ST-/-精母细胞和精子的蛋白质组变化。在精母细胞中,作者共鉴定了6871个蛋白质。在ES中评估的5,434个蛋白质中,作者发现在核糖体ST-/-精子中189个蛋白质上调,276个下调(图2e)。作者选择了17个下调的蛋白以及一个没有变化的蛋白进行分析或用PRM进行定向定量分析。成功地验证了他们的变化,证实了作者蛋白质组学数据的高质量。

为了评估由核糖体ST NPET折叠的蛋白质的特性,作者在生殖细胞发育的不同阶段测量了mRNA和蛋白质的表达,并分析了在核糖体ST-/-精子中下调的睾丸特异性蛋白质。用特异性测量法(SPM)来衡量睾丸偏向的表达。作者发现下调的蛋白与未改变和上调的蛋白相比显示出更高的平均SPM值27(图2f)。当作者将精子中删除核糖体ST下调的蛋白与小鼠精子蛋白质组进行比较时,发现80.4%的下调蛋白构成精子蛋白,明显高于其他蛋白的比例(图2g)。这些结果共同强烈地表明,核糖体ST主要负责调控在精子中特异性表达的蛋白质的生物合成。

接下来探究通过蛋白质组分析发现的蛋白质表达的变化是否是由转录水平的变化或翻译活性或蛋白质稳定性的变化引起的。对与纯化多聚体结合的mRNA的RNA测序(RNA-seq)分析表明,在核糖体ST-/-ES的蛋白质组中表现出不同表达的465个蛋白质中,只有10、0和1个蛋白质在核糖体ST-/-睾丸中分别表现出相应的RNA变化(图2h)。对于观察到的RNC-RNA和蛋白质组水平变化之间的差异,一个可能的解释是,蛋白质组的变化不是由转录或翻译活动的变化引起的,而是由蛋白质的稳定性引起

核糖体ST显示出一个独特的NPET结构

作者的结构分析表明,RPL39和RPL39L亚单位都存在于核糖体的同一位置,即NPET的出口附近(图3a-d)。在肾脏核糖体核心中,RPL39的Arg28的NH1与28S rRNA的G411的O2′之间的最近距离是4.4埃,RPL39的Arg36的NH1和NH2分别与28S rRNA的G412的OP2和O4′形成氢键(图3e)。在睾丸核糖体ST中,结果表明RPL39L的Gln28和Met36以及28S rRNA的G411和G412之间的相互作用比RPL39中的要弱(图3f)。由于这些较弱的相互作用,与RPL39形成的核糖体NPET相比,被RPL39L包围的核糖体NPET扩大了(图3a-d,g-h)。此外,RPL39L中保守的带正电荷的亲水性Arg28变为中性的亲水性Gln28,Arg36变为两性的Met36,改变了它的电荷和疏水特性,并改变了表面特性,因此影响了转译肽的出口路线,随后影响了新生肽的共翻译折叠(图3l)。总之,作者的研究结果清楚地表明,雄性生殖细胞使用一种特异性表达的RP,从而形成一个具有不同于体细胞中使用的NPET的核糖体ST

图 3:肾脏和睾丸核糖体中 RPL39/RPL39L 和 28S rRNA 之间的相互作用

核糖体ST促进了蛋白质的折叠

作者接下来分析了在核糖体ST-/-ES中下调的蛋白质的理化性质。作者发现,与不受核糖体ST缺失影响的蛋白质相比,它们的等电点、电荷和疏水性都表现得更高(图4a)。使用AlphaFold蛋白质结构数据库,作者发现,在ES中,α-螺旋结构的比例在N端区域增加(图4b),二硫键在下调的蛋白质的C端区域富集(图4c)。作者随后的富集分析显示,半胱氨酸是下调蛋白质中最明显富集的氨基酸。作者发现,核糖体ST的缺失导致N2a细胞中的总硫醇不变,但谷胱甘肽的水平下降,表明在核糖体ST-/-细胞中,蛋白质硫醇被上调,二硫化物的形成水平可能下降(图4d)。为了分析生殖细胞特异性蛋白的稳定性,作者以进行了环己胺追随分析。在PRM2-IRES-eGFP超表达的核糖体ST-/-细胞中,PRM2的稳定性在环己酮处理6小时后下降,H1FNT和CCIN的蛋白稳定性也以类似方式降低(图4e)。核糖体在合成过程中调节蛋白质的共翻译折叠。与野生型细胞相比,核糖体ST-/-N2a细胞中可溶性/颗粒的比例较低(图4f),表明蛋白质聚集的形成增加。动力学上稳定的蛋白质通常对十二烷基硫酸钠(SDS)的化学变性有抵抗力。作者接下来对耐SDS的蛋白质进行了SDS-PAGE检测。作者发现,在野生型N2a细胞中合成的PRM2和下调蛋白OAZ341,在无SDS缓冲液中培养后,在凝胶电泳过程中主要以其原生的形式减缓,而那些在核糖体ST-/-N2a细胞中合成的蛋白对SDS处理的抵抗力下降(图4g)。

图4:通过核糖体ST生物合成的功能蛋白的分析

小结:作者发现核糖体ST-/-小鼠在三种不同的核糖体ST基因敲除品系中都表现出精子形成缺陷。该研究的免疫荧光结果显示,Rpl39l-基因敲除的睾丸间质细胞中的RPL39蛋白水平下降,其原因需要进一步调查。作者推测,RPL39的减少可能是以前的研究和作者的研究之间观察到的不同表型和分子机制的原因。在这里,作者表明核糖体ST共翻译折叠了一个参与精子形成的蛋白质子集,并具有高稳定性的特点。作为唯一在男性体外执行其功能的细胞–即使卵子受精–精子从睾丸到附睾尾部大约需要10天的时间,并被储存起来直到释放到女性生殖道。这些生殖细胞特异性蛋白必须在精子中保持稳定,以确保精子在穿入卵细胞前的功能。作者的发现解决了一个长期存在的难题,即精子蛋白如何在其生命周期内保持功能和稳定性。

来源:高分子科学前沿

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