上海海洋大学考研，上海海洋大学考研分数线
随着人们生活水平的提高，食品安全已成为一个引起广泛关注的全球公共卫生问题。金黄色葡萄球菌是一类可引起人类头晕、腹泻、恶心、呕吐等急性肠胃炎的食源性致病微生物，开发准确可靠的诊断方法是实现金黄色葡萄球菌动态监测的重要保证。
上海海洋大学食品学院的后来旺、李达容、孙晓红*等人根据金黄色葡萄球菌高度保守的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，将重组酶等温扩增技术（RAA）与侧流层析试纸条（LFD）相结合，建立一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的RAA-LFD方法，并通过模拟样品与实际样品的检测进行可靠性验证，以期为牛奶及其制品中金黄色葡萄球菌的快速筛查提供技术支撑。
1、引物筛选
如图1所示，3 对引物均能扩增得到预期目的条带，其中第2对引物扩增目的片段大小为159 bp，扩增条带明亮且无杂带，扩增效率最高（图1A）。随后将第2条扩增产物割胶回收纯化后送至公司测序，测序结果与GenBank基因库相对应的序列进行比对，分析该序列同源性为99.4%～100% （图1B），表明第2对引物具有较高的特异性，因此选用第2对引物nuc-RAA-F2/nuc-RAA-R2用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因。
2、RAA-LFD反应条件优化
在引物浓度为12.5 nmol/L与25 nmol/L时试纸条T线未有条带，随着引物浓度的增加，LFD试纸条T线颜色加深，显色明显且稳定（图2A）。经ImageJ软件分析发现反应体系中引物浓度大于50 nmol/L时T线灰度值在不同引物浓度间存在显著差异（P＜0.05）（图2D）。随着引物浓度的增加有助于显色观察，但会加大引物二聚体产生的可能性，因此选择显色明显的200 nmol/L为最佳引物浓度。在不同反应温度条件下，试纸条T线亮度在较宽的温度范围内呈“拱形”变化（图2B）。在33～37 ℃时，试纸条T线颜色明亮清晰，结合ImageJ软件分析T线灰度值无显著差异（P＞0.05）（图2E），表明在33～37 ℃条件下更加有利于RAA反应酶与引物形成复合体，扩增效率更高。为使检测更加接近环境温度，因此选择33 ℃作为反应温度。在引物浓度200 nmol/L、温度33 ℃的基础上优化反应时间，RAA扩增超过20 min后检测线位置条带明亮且趋于稳定，裸眼可见并没有明显变化（图2C）。反应时间为20、25 min和30 min的产物T线灰度值无显著差异 （P＞0.05）（图2F），为保证实验的快速性选择20 min为RAA最佳反应时间。通过对RAA反应体系中引物浓度、反应温度与反应时间的优化，最终获得最佳反应条件为50 μL的反应体系中引物浓度为200 nmol/L，33 ℃反应20 min。
3、RAA-LFD检测特异性分析
以4 株金黄色葡萄球菌和10 株非金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板，对RAA进行特异性分析。如图3所示，4 株金黄色葡萄球菌在试纸条T线有阳性条带出现，而其他10 株病原菌经扩增后在试纸条T线位置未出现阳性条带，表明基于nuc基因保守序列设计的金黄色葡萄球菌扩增引物具有高度特异性。
4、RAA-LFD检测灵敏度分析
01
基因组DNA的检出限
如图4所示，随着金黄色葡萄球菌基因组DNA浓度的递减，T线条带亮度逐渐变弱，当基因组DNA质量浓度低至4 fg/μL时，仍可观察到T线有阳性条带。因此，RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌检出限为4 fg/μL DNA。
02
纯培养物的检出限
如图5所示，随着金黄色葡萄球菌纯菌液浓度的递减，T线条带亮度呈变弱趋势。当浓度为1.83×102 CFU/mL 时，T线仍可通过裸眼观察有阳性条带。因此，RAALFD方法检测金黄色葡萄球菌纯培养物检出限为 1.83×102 CFU/mL。本研究建立的RAA-LFD法对金黄色葡萄球菌纯菌液的检出限与多重PCR和LAMP法检出限一致，达到102 CFU/mL。
5、模拟牛奶样品检测
牛奶样品中分别加入103、102、101、100 CFU/mL金黄色葡萄球菌时，在未经富集（图6A、E）与富集2 h（图6B、F）的牛奶样品通过PCR与RAA-LFD均检测不到金黄色葡萄球菌；富集4 h后通过RAA-LFD可检测到1.83×102 CFU/mL 金黄色葡萄球菌（图6G），而采用PCR方法检测到1.83×103 CFU/mL金黄色葡萄球菌（图6C），表明在富集4 h时，RAA-LFD法检测牛奶中金黄色葡萄球菌的灵敏度高于PCR检测方法；在富集6 h后通过PCR与RAALFD检测结果一致，检出限低至1.83×101 CFU/mL金黄色葡萄球菌（图6D、H）。
6、实际样品检测结果
对采集的64 份牛奶样本分别进行RAA-LFD法、微生物生化鉴定法和PCR法检测，并用κ系数比较RAA-LFD法与其他2种方法结果的一致性，结果如表3所示。
结 论
本研究以金黄色葡萄球菌高度保守的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，建立了RAA-LFD快速检测方法，并优化确定最佳反应条件：50 μL的反应体系中引物浓度为200 nmol/L，33 ℃反应20 min。RAA-LFD法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA的检出限为4 fg/μL、纯菌液为1.83×10 2 CFU/mL，相比微生物生化鉴定法和PCR方法检测更为快速、灵敏。当人工污染牛奶样品量为1.83×10 1 CFU/mL金黄色葡萄球菌时，RAA-LFD法可在7 h内完成样品处理和检测。对采集的64 份牛奶样品进行检测，RAA-LFD法检测结果与微生物生化鉴定法、PCR法均具有较高的一致性。因此，在实验室资源有限的情况下，RAA-LFD法可作为牛奶及其制品中金黄色葡萄球菌快速筛查的有力手段。
本文《金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用》来源于《食品科学》2022年43卷4期331-339页，作者：后来旺，李达容，邓波，赵勇，潘迎捷，丰东升，孙晓红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201215-178。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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