中国农业科学院研究生(中国农业科学院研究生分数线)




中国农业科学院研究生,中国农业科学院研究生分数线

载体是分子生物学研究中的基础工具。在植物基因功能分析和分子育种中,不管是基因过表达、基因沉默还是基因编辑,都需要用到相应的载体。目前使用的植物表达载体主要是基于酶切-连接、Gateway、Golden Gate、Gibson Assembly等分子克隆技术,存在操作繁琐或价格昂贵等问题,使得当前的载体系统多种多样,尚未实现分子克隆领域的标准化。

近日,中国热带农业科学院热带生物技术研究所和海南医学院等单位的科研人员在植物学领域知名期刊 Plant Communications杂志在线发表题为“ A Nimble Cloning-compatible vector system for high-throughput gene functional analysis in plants ”的论文。该研究开发了一套基于Nimble Cloning的标准化植物表达载体, 为大规模的植物基因功能分析提供了一套高通量的载体工具,并为推动分子克隆领域标准化的形成奠定了基础。

Nimble Cloning(NC克隆)是热科院生物所在前期研究中开发的新型分子克隆技术。在此基础上,本研究继续开发了一套基于Nimble Cloning的植物表达载体(pNC载体系统),具有Nimble Cloning的主要优点:1. 操作简单。目标基因可以通过一步克隆反应直接连接到载体,避免了载体的酶切、回收过程。2. 标准化。该套载体均具有NC克隆的通用接头序列,目标基因携带通用接头后可克隆到该系统任一载体,解决了不同载体需要重新设计引物和扩增基因的问题(图1)。这两个优点使得pNC载体系统适合高通量的载体构建。

图1. Nimble Cloning载体结构和克隆反应示意图

该套载体工具由55个植物表达载体组成,包括15个过表达载体、3个基因沉默(RNAi)载体、14个蛋白亚细胞定位载体、16个蛋白互作(BiFC)载体、2个病毒介导的基因沉默(VIGS)载体、2个启动子活性分析载体和3个CRISPR-Cas9基因编辑载体,涵盖了多种常用的植物表达载体框架(植物T-DNA载体框架pCambia、pGreen和pBI121,以及植物瞬时表达载体框架)、抗性筛选基因(潮霉素、卡那霉素和除草剂抗性基因)和报告基因(GUS、GFP、CFP、RFP和mCherry)(图2),具备在植物研究领域广泛使用的基础。该套载体均具有用于Nimble Cloning的NC克隆框,形成了一套标准化的载体系统。

图2. pNC系统植物表达载体结构示意图

为验证这套载体的有效性,该研究进行了多种类型的植物基因功能分析。研究结果显示,目标基因可通过一步克隆反应(NC克隆)快速连接到该系统的不同载体,并且这些载体可有效地在植物中进行基因过表达、蛋白亚细胞定位、BiFC、RNAi、VIGS、启动子活性分析和CRISPR-Cas9基因编辑等研究, 为植物功能基因组研究提供了一个标准化的分析平台。 该套载体工具对科研人员开放共享。

热科院生物所的 言普青年研究员为论文的第一作者, 言普、 周鹏研究员和海南医学院的 高新征副教授为论文的共同通讯作者。该研究得到海南省自然科学基金和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项的资助。

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